Диагностика внутриутробных инфекций (ВУИ) у новорожденных — Медицинский журнал
Медицина как призвание

Диагностика внутриутробных инфекций (ВУИ) у новорожденных

диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных

диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных

Основная задача в диагностике внутриутробных инфекций у маленьких детей — это определение вредоносного микроорганизма вызвавшего заболевание. Существует большое количество диагностических методов — в этой статье мы рассмотрим основные.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Этот метод основан на выделении, многократном размножении и детекции ДНК. Метод изобретен в 1983 году Кэрри Мюллис, за что автор был удостоен Нобелевской премии.

Материал для исследования- ткань или кровь, содержащий ДНК (РНК) возбудителя.

ПЦР – это многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК  путем комплементарного достраивания ДНК матрицы, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.

Методика проведения ПЦР анализа включает три этапа:

1. выделение ДНК (РНК) из клинического образца;

2. увеличение числа копий специфических фрагментов ДНК;

3. детекция полученных копий  фрагментов ДНК.

Для выделения ДНК (РНК) клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раствора ДНК (РНК).

При многократном повторении циклов синтеза увеличивается число копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать лишь единичные клетки микроорганизмов, получить достаточное количество копий ДНК для идентификации их методом электрофореза. Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов, сначала получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транкрипции, катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

После этого проводят разделение полученных продуктов электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле и при осмотре в ультрафиолетовых лучах сравнивают с контрольным образцом ДНК.

Преимущества ПЦР:

— высокая чувствительность и специфичность;

— возможность диагностики латентной инфекции при наличии единичных микроорганизмов.

Недостатки ПЦР:

— высокая стоимость;

— специальное оснащение и организация лаборатории, подготовка персонала;

— применение возможно на базе крупных клиник и научно-исследовательских учреждений;

— низкая информативность для контроля излеченности, так как возможно определение ДНК нежизнеспособных микроорганизмов.

Метод иммуноферментного анализа  (ИФА).

ИФА – метод определения антител (качественно и количественно) или антигена в сыворотке крови. Применяется твердофазный ИФА, в качестве твердой фазы используются планшеты или шарики с адсорбированными на них антигенами или антителами. Для определения антител в лунки планшета с адсорбированным известным антигеном добавляют исследуемую сыворотку. Если в сыворотке есть антитела, то образуются соединения антиген-антитело, несвязанные антитела удаляются промыванием. К полученным иммунным соединениям добавляют антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (пероксидаза), затем субстрат для фермента (перекись водорода) и хромоген.  Полученный продукт имеет специфическую окраску, наличие и интенсивность которой определяют объективно в цифрах с помощью  специального прибора.

Против возбудителей вырабатываются и циркулируют в крови специфические антитела. При первичной инфекции вначале появляются антитела класса Ig М, затем Ig G и Ig А. Антитела Ig G появляются позже и их титр нарастает одновременно с падением титра антител Ig М (сероконверсия). Диагностика сероконверсии принципиально важна для беременных, когда решается вопрос о первичной вирусной  (герпес, цитомегалия, краснуха), токсоплазменной инфекции. Для этого применяют метод парных сывороток. При хронической инфекции титр антител Ig М может оставаться одинаково низким, а титр Ig G нарастает. После перенесенной инфекции антитела долго циркулируют в крови, а антитела Ig G остаются пожизненно.

Наличие в крови специфических антител Ig G свидетельствует о перенесенной в прошлом инфекции или текущей в настоящее время хронической инфекции.

Преимущества ИФА:

— возможность серийных (партиями) постановок;


— метод автомотизирован, результаты документируются;

— использование метода для массовых скринингов;

— диагностика сероконверсии (при первичной инфекции);

— диагностика инфекции любой локализации, когда недоступен биоматериал, содержащий антиген или ДНК.

Недостатки ИФА:

— необходимость определения двух классов антител в динамике;

— ложно отрицательный результат в ранние сроки после инфицирования, когда нет антител в достаточном количестве;

— низкая информативность для контроля излеченности, так как антитела длительно циркулируют в крови.

Метод иммунофлюоресценции (ИФ).

Этот метод выполняется с использованием люминесцентной микроскопии. Относительно свечения микроскопических объектов в литературе используют термины «люминесценция» и «флюоресценция» как однозначные. Вторичная (наведенная) люминесценция достигается путем обработки исследуемого материала химическим красителем (флюорохромом). В зависимости от применяемого красителя и его концентрации достигается свечение объекта от желто-зеленого до красно-оранжевого. Люминесцентная микроскопия выполняется с иммерсионным нефлюоресцирующим маслом.

ИФ используется для диагностики антигена возбудителя в биологическом материале, в котором содержится возбудитель. Для выявления антигенов микоплазм, уреаплазм, хламидий материал для исследования является соскоб эпителия слизистой оболочки уретры, цервикального канала. Исследуемый материал, содержащий антиген, наносится на предметное стекло, фиксируется спиртом и обрабатывается гомологичной сывороткой, меченой флюорохромом. При связывании антигена с антителом появляется яркое свечение, обнаруживаемое с помощью люминесцентной микроскопии.

В зависимости от способа окраски различают прямой и непрямой методы ИФ. Прямой метод ИФ: на препарат наносится люминесцирующая сыворотка, после соединения с антигенами меченные флюорохромом антитела дают свечение. Непрямой метод ИФ проводится в два этапа. Первый этап: на препарат наносится нефлюоресцирующая гомологичная сыворотка, комплексы антиген-антитело не флюоресцируют. Второй этап: на препарат наносится флюоресцирующая сыворотка против полученных комплексов антиген-антитело.

Преимущества ИФ:

— выполняются единичные исследования;

— простота и высокая скорость выполнения;

— возможность применения для скрининга, экспресс-диагностики;

— можно применять для исследования микропрепаратов из парафиновых блоков для диагностики внутриутробных инфекций.

Недостатки ИФ:

— низкая чувствительность и специфичность;

— субъективность в оценке мазка;

— невозможность документирования;

— точность диагностики зависит от качества взятия материала (обязательны клетки цилиндрического эпителия);

— низкая информативность для контроля излеченности, так как флюоресцируют антигены нежизнеспособных микроорганизмов.

Культуральный метод.

Этот метод основан на выделении возбудителей в чувствительной культуре клеток. Жесткие требования предъявляются к хранению и транспортировке клинического материала, который сразу после забора помещают в транспортную среду. После 24 часов хранения при температуре  + 4С или при – 20-70С вероятность роста микроорганизмов на культуре клеток резко снижается. Для проведения этого исследования требуются: культура клеток, ростовая среда, изолирующая и транспортная среды.

Преимущества культурального метода:

— оценка эффективности антибактериального лечения, так как на культуре клеток растут только жизнеспособные микроорганизмы;

— определение чувствительности и резистентности бактерий (хламидий) к антибактериальным препаратам;

— индивидуальный подбор химиопрепаратов.

Недостатки культурального метода:

— особенности транспортировки и хранения клинического материала;

— невозможность длительного хранения биоматериала;

— необходимость дополнительно использовать метод ПЦР для идентификации возбудителя;

— высокая стоимость и трудоемкость методики;

— реальный срок получения результатов – 7 дней.

Для более точной диагностики необходимо в сопоставлении с клиническими данными использовать одновременно не менее двух методов лабораторной диагностики: один – для определения  специфических антител, второй – для выделения возбудителя, определения  его антигена или ДНК.

ДОБАВИТЬ ОТЗЫВ